如何用实验证明细胞松弛素B在细胞中对微丝的作用有可逆性.CMU万岁

Question

如何用实验证明细胞松弛素B在细胞中对微丝的作用有可逆性.【CMU万岁】

Answer 1

实验目的】
1.掌握微丝的染色方法.
2.了解光镜和电镜下的微丝基本形态和结构.
3.了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理.
4.了解考马斯亮蓝染料在细胞生物技术中的应用.
【实验原理】
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架（cytoskeleton）,在维持细胞形状和运动方面具有重要作用.根据组成成分和组装结构的不同,分为微管（microtubule,MT）、微丝（microfilament,MF）和中间纤维（intermediate filament,IF）.微丝普遍存在于多种细胞,对细胞的形状和运动有一定作用.微丝由蛋白单体聚合形成,细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合,从而破坏微丝,改变细胞的形状.细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性.
考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue,R250）可以染各种蛋白,使蛋白呈蓝色.在该实验中微管等蛋白结构在光镜下无法分辨.我们看到的主要是微丝组成的应力纤维.
体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达,形态长而直,常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长.
【实验用品】
1.器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿,载玻片、吸水纸.
2.材料：盖片培养的成纤维细胞.
3.试剂：PBS (pH7.2)、1％TritonX-100溶液、 M-缓冲液、3％戊二醛固定 液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg/ml的细胞松弛素B、DMEM培养液.
【实验步骤】
1.从三张培养好的成纤维细胞贴壁生长的盖片平皿中,在超净工作台内将一张盖片移入另一平皿中继续培养,用作对照.
2.在有两片盖片的平皿内,去除培养基,用PBS洗3次,再加100μg/ml 的细胞松弛素B 4滴于盖片上,继续培养半小时.
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3.将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理,另一张用培养 液洗五次（在平皿内换五次培养液,每次都要摇动）,继续培养、观察.两小时后细胞形状恢复,接近正常.
4.对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理.
5.染色处理：
(1) 将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片,换液3次,每次3分钟,洗去培养液.
(2) 将盖片移入1％TritonX-100液处理25～30min,室温或37℃均可.以提取骨架以外的蛋白质,使骨架图像清晰.
(3) 立刻将盖片移入M-缓冲液,换洗3次,每次3min.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.
(5) 将盖片移入3％戊二醛固定10min.
(6) 将盖片移入0.2％考马斯亮蓝染液染液中,染色15min.然后小心地用自来水冲洗,空气干燥.
【结果与观察】
光镜观察,微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色,在没用药的标本上,成纤维细胞多数有突起,微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本,由于微丝被破坏突起缩回.多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本,由于解除了药的作用,肌动蛋白重新聚合成微丝,细胞形状恢复正常.
1.光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的张力纤维束（注意成纤维细胞中 微丝分布的特点）.
2.注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别.
3.观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常.
【注意事项】
1.洗片时要轻柔,以免把细胞从载片上洗去.
2.恢复时间要足够,否则细胞不会恢复到未处理前的状态.
3.操作中应注意区分细胞盖片的正反面.
4.染色后应冲洗盖片背面,避免损伤细胞.
5.1％TritonX-100抽提蛋白时,注意避免抽提时间过长破坏细胞结构.