肾小管间质炎症损伤有关的实验动物模型研究表明．由于肾小管上皮细胞中的骨调素（OPN）的过度表达，巨噬细胞趋化性浸润，造成肾小管浸润炎症损伤，可利用基因工程方法，采用反义RNA

Question

肾小管间质炎症损伤有关的实验动物模型研究表明．由于肾小管上皮细胞中的骨调素（OPN）的过度表达，巨噬细胞趋化性浸润，造成肾小管浸润炎症损伤，可利用基因工程方法，采用反义RNA技术对培养的肾小管上皮细胞骨调素表达量进行调节，回答有关问题：
（1）基因工程设计思路是通过向___细胞中导入___基因的方法，从而___细胞中OPN的表达量．
（2）用___酶处理含全长cDNA的重组质粒后获得全长cDNA．用___酶将cDNA以___两种方式与逆转录病毒载体相连．脂质体是由___双分子层组成，利用其___特点将目的基因导入到培养的细胞．
（3）目的基因表达检测：
①目的基因整合检测：
引物A（载体1511-1530）：5’-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3'
引物B（OPN761-740）：5'-ACTGCTCCAGGCTGTGTGTTTC-3'
引物C（OPN332-352）：5'-ATGGACGATGAT-3'
②用引物A和引物B扩增正向插入OPNcDNA片段，用引物___和引物___扩增反向插入OPNcDNA片段．

Answer 1

（1）由于肾小管上皮细胞中的骨调素的过度表达，巨噬细胞趋化性浸润，造成肾小管浸润炎症损伤，所以基因工程设计思路是通过向肾小管上皮细胞中导入骨调素mRNA的反义RNA基因的方法，使转录形成的反义RNA与mRNA特异性的互补结合抑制翻译过程，从而抑制细胞中OPN的表达量．
（2）目的基因的获得需要用限制性核酸内切酶切割含全长cDNA的重组质粒后获得全长cDNA，并用DNA连接酶将cDNA以正接和反接两种方式与逆转录病毒载体相连．由于脂质体是由磷脂双分子层组成，具有一定的流动性，从而可以将目的基因导入到培养的细胞．
（3）根据引物中的碱基序列，用引物A和引物B扩增正向插入OPNcDNA片段，用引物A和引物C扩增反向插入OPNcDNA片段即可．
故答案为：
（1）肾小管上皮   骨调素mRNA的反义RNA   抑制
（2）限制性核酸内切   DNA连接酶   正接和反接   磷脂    流动性
（3）引物A和引物C