分子量120kDa,转膜条件求助最近一个月,蛋白一直做不顺,蛋白分子量120KD,转膜时间2H~半干转：切NC膜4.5cm*1.5cm,转膜电流7mA,2h~转完染膜染胶,上面什么都没有湿转：NC膜转膜电流250mA,2h~转完染膜染

Question

分子量120kDa,转膜条件求助
最近一个月,蛋白一直做不顺,蛋白分子量120KD,转膜时间2H~
半干转：切NC膜4.5cm*1.5cm,转膜电流7mA,2h~转完染膜染胶,上面什么都没有
湿转：NC膜 转膜电流250mA,2h~转完染膜染胶都有蛋白,还要再延长时间么……加到250mA~300mA,还是没做出来；PVDF膜,300mA 2h,试了两次,之前用甲醇泡过15-20min激活的,膜有点花,转完膜染胶还是有残留,染膜没怎么看到蛋白,也有注意用冰袋降温了……marker转膜完能看到,脱脂牛奶封闭2h以后膜的颜色不花了,但是marker看不清楚了……
之后一抗santa 1:200 4℃过夜,二扛ICL 1:5000
β-actin用半干转一直都很好,总感觉目的条带不出来可能问题在转膜上,
1、我的转膜条件是不是有问题,如果是,需要怎么调整?
2、湿转液配的时候,120KD需要加SDS么?

Answer 1

我用的是湿转,我跑分子量130的.没有加SDS.用的是PVDF膜,甲醇活化一般只用半分钟到一分钟,就放入去离子水中泡着待用了.转膜时,是恒流300mA,基本就转1.5-2h.一般没问题的呀.我觉得你检查一下你的转膜缓冲液（我一般不重复用）,还有就是铺膜有没有气泡.另外实在找不到原因可以适当延长转膜时间,但也不可以太长.其实120KD转两小时足够了.
另外,我有时封闭后也会marker看不清楚,影响不大,只要还能辨别marker的条带就ok了.