SDS碱裂解法制备质粒DNA的具体操作步骤是怎么样的?那位大侠给力点,帮下忙

Question

SDS碱裂解法制备质粒DNA的具体操作步骤是怎么样的?那位大侠给力点,帮下忙

Answer 1

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等.各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代.
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子.目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA.
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来.
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质.例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时.对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用.
一、试剂准备
1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0）.1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml,0.5M EDTA（pH 8.0）10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml.在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃.
2.溶液Ⅱ：0.2N NaOH,1% SDS.2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml.使用前临时配置.
3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液,pH 4.8.5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml.4℃保存备用.
4.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml,0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml,加ddH2O至100ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7.5×TBE：Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃.
10.6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%（W/V）蔗糖水溶液.
11.1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂,操作时带手套）,轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE）,即可上样.
二、操作步骤
1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）.
2.取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽.
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀.
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀（不要剧烈振荡）,并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清）.
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g × 10min.
7.小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min.
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.
9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml）,37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用.
三、质粒DNA的电泳检测
观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色.该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,其荧光产率比游离染料溶液有所增加.DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收.这两种情况下,被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来.因此,当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA.
取制备的质粒DNA 1-2μl,加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压,使DNA分子从负极向正极移动至合适位置,取出凝胶置紫外灯下检测,摄片.
四、注意事项
本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好,一般无麻烦.若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割,可通过酚/氯仿再次抽提,以清除杂质来解决问题.