为什么我们基因克隆老失败我们做的是拟南芥中一些基因cds的克隆,在设计引物时加上酶切位点,PCR之后通过酶切与载体相连.但是为什么老是失败,起初我们直接切得PCR产物,由于那样切没切开

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为什么我们基因克隆老失败
我们做的是拟南芥中一些基因cds的克隆,在设计引物时加上酶切位点,PCR之后通过酶切与载体相连.但是为什么老是失败,起初我们直接切得PCR产物,由于那样切没切开看不出来,所以我们先把PCR产物连在T载体上再切T载体,但是且过之后还是老连不上.有时候转化都长出菌落了但是菌落PCR却做不出来.我们用的T载体有pMD18-T pGM-T pEASY-T.请高人给一些克隆方面的指点吧,我们现在的进度一个月能做成一个克隆就不错了.

▼优质解答

答案和解析

1 建议你直接切PCR产物,在酶切位点两端加2~3个保护碱基再切.这样避免两次纯化的麻烦.我都是这么做的.
2 你的T载体连接成功了么?就是有没有拿到重组T载体?
3 你用的是Taq还是高保真聚合酶?如果是Taq的话当心是在引物区或酶切位点造成点突变使得切不动.

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