RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u

Question

RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,
最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,
我的PCR条件是这样的
模板1ul （浓度100ng）
引物上下游各1ul （浓度10uM/L）
pcr mix 10ul （用过biotek的mix,也用过takara 的EX Taq HS）
rnafree水 7ul
94℃ 5min
94℃ 30s
55-60℃ 30s
72℃ 1min
72℃ 10min
目的条带从173到690不等
内参跑出来了而且很清晰,所以我觉得我的cdna模板没有问题,
一开始认为是引物问题,就又查阅了很多英文文献,把引物全都用Oligo7软件验证了,选择了最理想的几对引物,
现在很困惑,想请高手们帮我分析下原因,
自己也查阅过网上的解答,
1.引物浓度问题,引物浓度过大会引起二聚体,但是我查阅过有些文章说引物的工作浓度20uM/L比较合适,所以我20ul体系各加1ul似乎不是很高啊,而且内参也是这个加的这个量,内参跑出来了
2.退火温度问题,退火温度我做过梯度,一样,都没有条带,只有二聚体
3.模板浓度问题,我的模板浓度是100ng,不知道是不是合适
4.Mg2+浓度问题,有不少文章提到Mg2+浓度对实验影响很大,但是我不知道如何调整,Mg2+应该是在我买的pcr mix里面吧?那减少mix的量?如果这样的话酶的量不是也少了么
5.引物设计的问题,我发现primer5和Oligo7验证的结果很不一样啊,primer5设计出来的引物用OLigo验证都不太好,Oligo设计出来的引物,用primer5验证都很差,所以我没敢自己设计,还是找了很多文献,用Oligo验证,我选择的几对引物中,虽然有的显示会形成二聚体,但△G都比较低,在PCR那个选项出来的结果中也都没有提示,说明应该可以接受啊.
6.有不少文献中的引物经过Oligo验证,都提示 上下游引物溶解温度差别大,所以我没有选用,我一直很困惑,很多文献的引物我验证了都不太好,为啥人家还能做出结果呢?
7.最后还有个问题就是加试剂顺序的问题,我喜欢先加水,然后加mix,然后加引物,最后加模板,这样是不是不太好,是不是应该最后加mix?
暂时这么多问题,再做不出来我要崩溃了- -
补充一个问题,
8.酶效率问题,会不会是我的酶效率不好呢?预变性时间5min应该不短了吧,如果循环中的变性时间加到45s试试会不会有改善呢?

Answer 1

1.我觉得这个浓度的引物是偏高的,我50ul体系用这个可以p得很清晰了,不过引物只要设计得好引物二聚体不神马的我觉得不是问题.
2.mix我也用bioteke的,25ul*2的,我觉得很好条带很亮,甚至比我用MBI的,TAKARA的都好,
3.模板浓度我觉得需要摸索,模板的量和正确性也很重要.不过如果做过摸索都P不出来我觉得是你模板DNA的问题,是否验证过是正确的.
4.用mix就不要再考虑mg啦,要就自己配来做条件摸索吧,不过我觉得没必要.
5.我也是用primer设计oligo验证,只能说评价感觉的确不太匹配,不过在使用中我primer中评价很一般的引物我都可以做出来,我觉得这些评价软件其实也不能太做准.
6.我习惯顺序是模板-引物-mix-水,我没做过20ul的,最少也25ul,而且我觉得这个问题的答案是随你便,只要混匀了先加哪个有什么关系?
7.预变性5min足够了,循环中的变性以你的产物长度来说30s也够了,不过不放心可以改啊,条件是摸索出来的嘛.
最后总结：我觉得引物第一,模板第二,其他神马的只要按PCR的规则随便都可以做出来,做得好不好看而已,你有没有考虑过模板物种问题?是不是没混匀?机器问题?上样问题?试剂存放时间问题,我觉得做不出来要细心地找原因.
我也不是什么老手,尽我所能而已,祝你好运.