肌糖元酵解实验中,在乳酸测定的过程中,为什么先要进行冰浴并随时注意冷却?

Question

肌糖元酵解实验中,在乳酸测定的过程中,为什么先要进行冰浴并随时注意冷却?

Answer 1

肌糖元的酵解作用 1. 2. 3. 目的要求 学习鉴定糖酵解作用的原理和方法. 了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义. 了解有关组织代谢实验应注意的一些问题. 原理 在动物、 植物、 微生物等许多生物机体内, 糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行. 本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例. 肌糖元的酵解作用, 即肌糖元在缺氧的条 件下,经过一系列的酶促反应,最后转变成乳酸的过程.肌肉组织中的肌糖元首先磷酸化, 经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物,最后生成乳酸.该 过程可综合成下列反应式： （1/n）(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH 肌糖元的酵解作用是糖类供给能量的一种方式. 当机体突然需要大量的能量, 而又供氧 不足（如剧烈运动时） ,则糖元的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要.在有氧条件下,组 织内糖元的酵解作用受到抑制,而有氧氧化则为糖代谢的主要途径. 糖元酵解作用的实验,一般使用肌肉糜或肌肉提取液.在用肌肉糜时,必须在无氧条件 下进行；而用肌肉提取液,则可在有氧条件下进行.因为催化酵解作用的酶系统全部存在于 肌肉提取液中,而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统,则集中在线粒体 中. 糖元或淀粉的酵解作用,可由乳酸的生成来观测.在除去蛋白质与糖后,乳酸可以与硫 酸共热便成乙醛,后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质,根据颜色的显现加以鉴定. 该法比较灵敏,每毫升溶液含 1——5ug 乳酸即给出明显的颜色反应.若有大量糖类和蛋白 质等杂质存在,则严重干扰测定,因此实验中应尽量除尽这些物质.另外,测定时所用的仪 器应严格地洗干净. 试剂和器材 1、 材料：鸡或兔的肌肉糜 2、 试剂： 1) 2) 1／15mol/L 磷酸缓冲液(pH7．4)： 对羟基联苯试剂：称取对羟基联苯 1．5g 溶于 100ml 0.5％NaOH 中,配成 1．5％ 的溶液.若对羟基联苯颜色较深,应用丙酮或无水乙醇重结晶,放置时间较长后, 会出现针状结晶,应摇匀后使用. 3) 4) 5) 6) 7) 8) 3、器材 试管及试管架；移液管：5m1、2m1、1ml、0.5ml；电子天平；滴管；玻璃棒；恒温水浴； 1 淀粉溶液：0.5% 液体石蜡 CuSO4 饱和溶液 Ca（OH）2 粉末： 20%三氯乙酸 浓硫酸 沸水浴； 漏斗；冰浴；滤纸；量筒；旋涡搅拌器 操作方法 一、处死动物和制备肌肉糜 二、肌肉糜的糖酵解 取 4 支试管,编号后各加入新鲜肌肉糜 0.5 克.1,2 号管为样品管,3,4 号管为空 白管.向 3,4 号空白管内加入 20%三氯乙酸 4mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散,搅匀, 以沉淀蛋白质和终止酶的反应. 然后分别向 4 支试管内加入 4mL 磷酸缓冲液和 1mL0.5% 淀粉溶液.3,4 管用玻璃棒充分搅匀,加液体石蜡以隔绝空气,并将 4 支试管同时放入 37℃恒温水浴中保温. 1h 后,取出试管,立即向 1,2 号试管内各加入 20%三氯乙酸 4mL,充分混匀,过滤. 然后向每管（一次性试管）内加入饱和硫酸铜溶液 1mL,混匀,再加入 0.4 克氢氧化钙 粉末,充分搅匀 2min,放置 10min,使还原糖沉淀完全,过滤,保留滤液. 三、乳酸的测定 取 4 支洁净、干燥试管,编号,各加入浓硫酸 2mL,将试管置于冰水浴中冷却,分 别取每个样品的滤液 2 滴,直接加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中,随加随摇动试管, 避免试管内的溶液局部过热.将每个试管混合均匀后,放入沸水浴中煮 5min,加入对羟 联苯试剂 2 滴,混匀试管内容物,比较和记录各管溶液的颜色深浅,并加以解释. 试管编号 肌肉糜 三氯乙酸 淀粉溶液 磷酸盐缓冲液 1 2 0.5g 3 4 4mL 各加 1mL 4mL 加液体石蜡封口,37℃水浴保温 1h 三氯乙酸 4ml 吸出液体石蜡,取 4 支试管过滤,分别取滤液 5 毫升 饱和 CuSO4 Ca(OH)2 粉末 各加 1.0ml 各加 0.4 克 充分搅拌,振荡 2min,静置 10min ,过滤 另取 4 支洁净干燥的 10ml 试管,各加 2ml 浓 H2SO4 置于冰浴中,分别加 入溶液 2 滴,边加边摇,混匀,放入沸水浴中 5min,加入显色液 2 滴, 取出冷却,比较颜色,分析结果 2 注意事项 1. 对羟基联苯试剂一定要经过纯化,使成白色. 2. 在乳酸测定中, 试管必须洁净、 干燥, 防止污染, 影响结果.所用滴管大小尽可能一致, 减少误差.若显色较慢,可将试管放入 37℃恒温水浴中保温 10min,再比较各管颜色. 思考题 1、人体和动植物体中糖的储存形式是什么?实验中如果用淀粉或糖元代替葡萄糖能否证明 一定是糖酵解的酶失活吗? 2、试述糖酵解作用的生理意义. 3、本实验的关键环节是什么,应采取什么措施,为什么? 4、研究组织代谢实验应注意一些什么问题? 5、 如果样品管在加入葡萄糖后和空气充分接触, 然后再加石蜡封口, 实验结果会有不同吗? 为什么? 6、糖酵解作用的关键酶是什么?机体中该酶的活性会受到高能荷的抑制,在本实验中这种 情况会发生吗?你怎样证明?