转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入线粒体和叶绿体，增强相关细胞器的功能．为增加油菜籽的含油量，研究人员分别从陆地棉和拟南芥中克隆了酶N基因和转运肽基因，并连接形成融合

Question

转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入线粒体和叶绿体，增强相关细胞器的功能．为增加油菜籽的含油量，研究人员分别从陆地棉和拟南芥中克隆了酶N基因和转运肽基因，并连接形成融合基因，将其导入油菜后，获得了高油转基因油菜．
（1）在已知酶N基因、转运肽基因的上游及下游碱基序列的情况下，可人工设计合成___用于和模板单链结合，作为多聚核苷酸链延伸的起点．在PCR扩增中所需的关键酶是___．
（2）酶N基因和转运肽基因的限制酶切点如图1，形成融合基因前，应用限制酶___处理两个基因，再用___连接成融合基因．

（3）Ti质粒存在于农杆菌中，构建目的基因表达载体时，应将上述融合基因插入Ti质粒的___区，所用的限制酶为___．目的基因表达载体导入农杆菌时，将农杆菌接种在含___的平板上培养得到含融合基因的单菌落，再经纯培养得到浸染液
（4）浸染液中农杆菌在感染油菜时，将融合基因导入油菜细胞并整合到染色体DNA上，这个过程称为___．利用___进行分子杂交，通过检测杂交带的有无，可判断融合基因是否稳定的存在和表达．

Answer 1

（1）在已知酶N基因、转运肽基因的上游及下游碱基序列的情况下，可人工设计合成引物用于和模板单链结合，作为多聚核苷酸链延伸的起点．在PCR扩增中所需的关键酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶）．
（2）酶N基因和转运肽基因的一端都有限制酶 Sac I的识别序列，因此形成融合基因前，应用限制酶Sac I处理两个基因，以形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接成融合基因．
（3）融合基因一端有限制酶Cla I的识别序列，另一端有限制酶Xba的识别序列，因此构建目的基因表达载体时，应将上述融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，所用的限制酶为Cla I、Xba．由图可知，标记基因是四环素抗性基因，因此目的基因表达载体导入农杆菌时，将农杆菌接种在含四环素的平板上培养得到含融合基因的单菌落，再经纯培养得到浸染液
（4）浸染液中农杆菌在感染油菜时，将融合基因导入油菜细胞并整合到染色体DNA上，这个过程称为转化．利用放射性物质标记的基因（融合基因或酶N基因及转运肽基因）、抗体进行分子杂交，通过检测杂交带的有无，可判断融合基因是否稳定的存在和表达．
故答案为：
（1）引物   Taq酶
（2）Sac I   DNA连接酶
（3）T-DNA     Cla I、Xba      四环素
（4）转化      放射性物质标记的基因（融合基因或酶N基因及转运肽基因）、抗体