透明质酸酶临床常用作药物渗透剂，目前市场上出售的透明质酸酶主要从动物组织中提取，成本高且提纯困难．科研人员尝试将透明质酸酶基因（Hyl）高效表达；重叠延伸PCR是一种定点突变

Question

透明质酸酶临床常用作药物渗透剂，目前市场上出售的透明质酸酶主要从动物组织中提取，成本高且提纯困难．科研人员尝试将透明质酸酶基因（Hyl）高效表达；重叠延伸PCR是一种定点突变技术，主要设计思路是用具有互补配对片段的引物，进行PCR1和PCR2获得部分重叠的两种 DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠部分的互补和延伸获得目的基因．其过程如图所示，Nco I和XhoI为限制酶识别位点．请分析回答下列有关问题：

（1）步骤②中所用到的工具酶有___，NcoⅠ切割___键．
（2）步骤①进行定点突变的目的是___，将透明质酸酶基因转入大肠杆菌使其高效表达，利用了大肠杆菌的___特点，导入大肠杆菌时，首先要用___处理．
（3）在利用重叠延伸PCR进行定点突变时需要如图所示四种引物，若PCR1所用引物为引物1和引物3，则PCR2时B 点所选用的引物是图中的___，如果突变后的透明质酸酶基因进行PCR，所选的引物为___．
（4）谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶是长期用于病毒性肝炎患者肝功能的检测指标．最近，研究者提出检测空腹血清透明质酸酶水平了解肝硬化患者的肝损害程度，请分析其机理．___．

Answer 1

（1）步骤②表示基因表达载体得到构建，该过程中首先需要利用同种限制酶切割目的基因和质粒，再利用DNA连接酶构建重组质粒，限制酶切割的是磷酸二酯键．
（2）分析图解可知，图中目的基因的中间存在NcoⅠ限制酶的切割位点，因此步骤①进行定点突变是为了防止限制酶（NcoI）破坏目的基因；由于大肠杆菌具有繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少特点，因此常作为基因工程的受体细胞，并且目的基因导入大肠杆菌时，首先要用Ca²⁺处理，使其成为感受态细胞．
（3）在利用重叠延伸PCR进行定点突变时需要如图所示四种引物，若PCR1所用引物为引物1和引物3，则PCR2时B点所选用的引物是图中的引物4，如果突变后的透明质酸酶基因进行PCR，所选的引物为引物1和引物2．
（4）正常情况下，透明质酸酶在细胞中存在，血清透明质酸酶高，说明肝细胞坏死增多，因此可以通过检测空腹血清透明质酸酶水平了解肝硬化患者的肝损害程度．
故答案为：
（1）限制酶和DNA 连接酶      磷酸二酯键
（2）防止限制酶（Nco I ）破坏目的基因   繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少   Ca²⁺
（3）引物4   引物1 和引物2
（4）正常情况下，透明质酸酶在细胞中存在，血清透明质酸酶高，说明肝细胞坏死增多