（2014•崇明县一模）斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码．利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因（G）整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光．具有纯合突变基因

Question

（2014•崇明县一模）斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码．利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因（G）整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光．具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光．未整合G基因的染色体的对应位点表示为g．图1和图2所示分别为实验所用的质粒上相关酶切位点以及含绿色荧光蛋白基因（G）的外源DNA片段上具有的相关酶切位点．

（1）将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上的实验过程中，首先要将G基因与质粒重组，此过程需要的两种工具酶是______．
（2）经筛选获得的重组质粒需要经显微注射到斑马鱼的______细胞中加以培养、筛选．如果培养得到的胚胎能______，说明G基因已经成功整合到染色体上并且该基因已经得以表达．
（3）用图1中的质粒和图2外源DNA构建重组质粒，不能使用______切割，原因是______．如果要防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，则应选择下列方法______为好．
①只使用EcoR I处理      ②使用BamH I和SmaⅠ同时处理
③使用BamH I和HindⅢ④使用Sma I和HindⅢ同时处理
（4）现用转基因个体N和个体M进行如下杂交实验得到的子代胚胎表现型如图3所示，推测亲代M的基因型是______．

（5）杂交后，出现红•绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是______，导致染色体上的基因重组．（提示：哪一亲本在什么生理过程中发生什么行为）
（6）子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括______（选填选项前的序号，可多选，①DDGG  ②DDGg  ③DdGg  ④DdGG），并画出其染色体上相关基因组成的图解．

Answer 1

（1）将G基因与质粒重组的过程中，首先需要限制酶切割含有目的基因的DNA片段和运载体，其次需用DNA连接酶将目的基因G和质粒连接形成重组质粒．
（2）受精卵细胞的全能性高，因此需将筛选获得的重组质粒经显微注射到斑马鱼的受精卵细胞中加以培养、筛选．若G基因已经成功整合到染色体上并且该基因已经得以表达，则培养得到的胚胎能发出绿色荧光．
（3）由于目的基因和质粒的抗性基因上都含有限制酶SmaⅠ的切割位点，用SmaⅠ切割会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因，因此用图1中的质粒和图2外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割．用限制酶Sma I和HindⅢ同时处理，既可防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，也可以防止目的基因和质粒反向连接．
（4）由图可知，D和d基因、G和g基因都位于同源染色体上，它们表现为连锁遗传．现用转基因个体N（DdGg）和个体M（胚胎期无荧光，基因型为D_gg）进行杂交实验，得到子代胚胎中有绿色荧光（D_G_）、红色荧光（ddgg）、无荧光（Ddgg）、红•绿荧光（Ggdd），由此可推测亲代M的基因型为Ddgg．
（5）M（Ddgg）×N（DdGg）→红•绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎，可能是亲代N的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致染色体上的基因重组．
（6）亲本的基因型为Ddgg×DdGg，且两对等位基因位于一对同源染色体上，表现为连锁遗传，因此子代中只发出绿色荧光的胚胎（D_G_）的基因型包括②DDGg（M的DG与N的Dg组合形成）、③DdGg（M的DG与N的dg组合形成、M的17号染色体交换形成的dG与N的Dg组合形成），其染色体上相关基因组成的图解为：．

故答案为：
（1）限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶
（2）受精卵（早期胚胎）    发出绿色荧光
（3）SmaⅠSmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因     ③
（4）ddGg   
（5）亲代N的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换
（6）②、③