做LD-PCR时为什么要用尽量少的循环数建cDNA文库时第二链cDNA合成时

Question

做LD-PCR时为什么要用尽量少的循环数
建cDNA文库时第二链cDNA合成时

Answer 1

RT-PCR法是反转录聚合酶链RNA（RT）和cDNA扩增（PCR）技术的结合.第一是逆转录酶从RNA合成cDNA的作用,然后以cDNA为模板,扩增片段的合成.RT-PCR技术是敏感的和广泛的应用,可用于检测基因的表达水平在细胞中,特定基因的含量和RNA病毒在细胞中的cDNA序列的直接克隆.的RNA作为模板可以是总RNA的RNA,mRNA表达,或体外转录的产物.不管是RNA,关键是要确保没有污染的RNA的RNA,酶的基因组DNA.（如产品目录号DP405和DP406）,核糖核酸得到纯度高,少的基因组DNA污染,可以得到用于时报公司的总RNA提取系统中使用的空间,RT-PCR系统用于令人满意的结果.
情况引物进行反转录实验来选择视觉随机引物,寡聚dT引物和基因特异性之一.对于短真核生物mRNA的发夹结构不具有三个可用.选择
的RT-PCR引物
随机引物：具有发夹结构的长期或RNA.适合用于逆转录反应的rRNA,mRNA和tRNA和所有的RNA.主要用于单个反应RT-PCR的模板.
寡聚dT：适合的RNA聚腺苷酸尾.（核糖核酸原核生物,真核生物寡聚dT的rRNA和tRNA不具有polyA尾.）寡聚dT由于结合于聚腺苷酸尾,所以RNA样品的质量高,即使少量也会使全长cDNA的降解合成大大降低.
基因特异性引物：和引物与模板互补的序列,该序列是适合于此目的的是已知的.天太引物代公司的SuperScript一步系统特别适合于用基因特异性引物一起使用.
RT-PCR因子
RT-PCR反应中由许多因素,如硫酸镁,扩增循环数等的引物的退火温度的浓度.
◇建议选择0.53.0毫米的硫酸镁（0.5毫米之处）的初步实验.
◇引物具有较高的Tm,增加的退火时间和反应温度是有利的延长.较高的温度有利于减少非特异性引物的结合,从而提高了特定产品的产率.
◇最靶RNA由40 PCR反应中可以观察到.但是,如果上述目标RNA太稀少或只有少量的起始物质,它是必要的,以增加扩增的45-50倍.