叶盘法中作为外植体的叶片要用什么消毒,怎样消毒?运用在组培上的转化所用

Question

叶盘法中作为外植体的叶片要用什么消毒,怎样消毒?
运用在组培上的转化所用

Answer 1

先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养,需将叶子背面接触培养基
(1)外植体的预培养
预培养的作用:(1)促进细胞分裂,分裂状态的细胞更容易整合外源DNA因而提高外源基因的瞬时表达和转化率.(2)田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用,使外植体适应于试管离体培养条件,并保持活跃的生长代谢状态.(3)减少外植体转化过程中的杂菌污染率;如果外植体上带污染源时,在预培养被筛选掉.(4)有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触.因为外植体在开始培养过程中,由于其迅速生长而出现上翘或卷曲,使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌不能生长实现转化.
外植体的预培养时间:每一种外植体均有其最佳预培养时间.预培养时间太长降低外植体的转化率,甚至农杆菌侵染后外植体死亡.一般以2-3 d为直,例如矮牵牛,番茄,拟南芥菜叶片转化均需2d预培养.
否需要预培养,预培养多长时间,要根据不同植物,不同外植体而确定.
(2)外植体的农杆菌接种
外植体接种就是把工程菌接种到外植体的损伤切面.
方法是将切割成小块的外植体浸泡在制备好的工程菌液中,浸泡一定时间后,尚需用无激素植物培养基或无菌水漂洗,再用无菌吸水纸吸干.但目前外值体用菌液浸泡后常不经漂洗,直接放在无菌吸水纸上吸干外植体非伤口面的菌液,即可进行共培养.
在接种过程中应注意以下几点:
掌握外植体在菌液中浸泡的时间:有助于减少后继培养中可能造成的污染,并可减轻细菌对植物细胞的毒害作用,一般控制在数秒钟至数分钟内,以叶盘边缘充分湿润为度.浸泡时间太短农杆菌尚未接种到伤口面,在其培养时无农杆菌生长,不能转化.如果外植体在菌液中浸泡时间太长,常因农杆菌毒害缺氧而软腐,一般不要超过30mln.
菌液浓度:对不同植物的外植体而言有一定差异,一般浓度范围是 OD600=0.05～0.7之间.对农杆菌敏感的植物,因其易产生过敏反应而导致外植体切口处褐化,故常采用较低的OD值和较短的浸泡时间.
浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度,如果暴露时间太长造成外植体失水萎回;吸得太干在共培养时切口面无农杆菌生长.因此要明确滤纸吸干的原则是除去过量的菌体.