血管内皮生长因子（VEGF）能促进眼部视网膜血管的病理性生长．临床上可用VEGF抗体的Fab片段（即抗体的活性片段）作为药物治疗视网膜病变．如图所示是利用大肠杆菌来大量合成该抗体片

Question

血管内皮生长因子（ VEGF）能促进眼部视网膜血管的病理性生长．临床上可用VEGF抗体的Fab片段（即抗体的活性片段）作为药物治疗视网膜病变．如图所示是利用大肠杆菌来大量合成该抗体片段的技术路线图，请回答下列问题：

（1）图中的质粒在基因工程中常作为___，抗卡那霉素基因和抗四环素基因当作___．其中的核心步骤是___（填图中标号）
（2）科学家已经测出VEGF的抗体Fab片段的氨基酸序列，因此可以通过___方法来获取目的基因．获取目的基因后，还需要在其两端加上限制酶HindⅢ和XhoⅠ识别序列和启动子T₇等序列，T₇的位置应该在___（填l、2、3或4）处．
（3）大肠杆菌常用___处理，使之成为___细胞，以便吸收外源DNA；与重组质粒混合培养一段时间后，用分别添加卡那霉素和四环素的培养基进行筛选；如果大肠杆菌在添加卡那霉素的培养基中___，在添加四环素的培养基中___，则为需要的目的菌株．
（4）对筛选出的大肠杆菌中目的基因是否成功表达，可以用___技术进行检测．即用___与提取出的蛋白质杂交来鉴定是否合成抗体Fab片段蛋白．

Answer 1

（1）图中的质粒在基因工程中常作为（运）载体，抗卡那霉素基因和抗四环素基因当作标记基因．基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，对应图中的步骤①．
（2）科学家已经测出VEGF的抗体Fab片段的氨基酸序列，因此可以通过人工合成法来获取目的基因，即根据Fab片段的氨基酸序列推测出信使RNA序列，再推测出结构基因的核苷酸序列，然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成．获取目的基因后，还需要在其两端加上限制酶HindIII和XhoI识别序列和启动子T7等序列，启动子应位于目的基因上游，且不能被限制酶切割去除，因此T7的位置应该在图中的2或3处．
（3）大肠杼菌经Ca²⁺处理，成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞，以便吸收外源DNA；由图可知，构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，而卡那霉素抗性基因没有被破坏，因此在培养基需添加卡那霉素以筛选目的菌株，即大肠杆菌在添加卡那霉素的培养基中能生长（或“能形成菌落”），在添加四环素的培养基中不能生长（或“不能形成菌落”）．
（4）将筛选出的大肠杆菌进行扩大培养，可以用血管内皮生长因子（VEGF）作为抗原与提取出的蛋白杂交来鉴定是否合成抗体Fab片段蛋白．
故答案为：
（1）（运）载体      标记基因       ①
（2）人工合成（化学合成）    2或3 （答“2”或“3”均给分）
（3）Ca²⁺（或CaCl₂）    感受态    能生长（或“能形成菌落”）    不能生长（或“不能形成菌落”）
（4）抗原-抗体杂交      血管内皮生长因子（VEGF）