我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.此引物是做miRNA逆转录用的，

Question

我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.
此引物是做miRNA逆转录用的，不需要变性。

Answer 1

就问题本身而言,引物合成回来是固体粉末,你把它溶于水中,再做一步变性退火就行了（不过由于是hairpin,形成二聚体的可能性也很大,这个似乎不可避免）.
另外我不太明白为什么要用hairpin的引物?在pri-miRNA甚至pre-miRNA的两臂上设计引物,都可以PCR出miRNA片段.不知兄弟为何要设计hairpin引物?怎样的“克隆miRNA”,能否稍微详细的介绍一下实验思路?大家一起讨论.
看了你的原理图,大概明白了,其实就是用RT-PCR检测样品中某微量miRNA的含量,差不多吧?
我个人意见是,如果你引物序列没问题,它自己在实验时就会形成hairpin.不用预先把引物变成hairpin的理由有二.
1、实验的第一步,应是在样品中加入你的引物,准备退火.但退火之前必然有一个95度变性,然后退火.否则,样品中的miRNA可能有二级结构,不能以单链形式与你的引物互补,那就检测不到了.
既然有高温变性,那么你之前把引物退火形成hairpin就没意义了,因为在这一步同样会打开.
2、退一步讲,即使不形成hairpin,对实验的影响也不大.因为你的目的是通过引物的3'长臂端与miRNA互补,然后延伸,探针检测延伸出来的片段（绿色部分）.那么即使红色片段为线性,不是hairpin,只要序列没有问题,同样可以进行延伸的步骤,对你之后的PCR也没有太大影响（可能有错配的问题,看你引物设计的情况了）.既然整个实验红色引物是否是hairpin都没什么关系,又何必之前非要把它变成hairpin呢?
根据你的补充：
我不同意你的意见,我个人认为引物需要变性.引物中如果有茎环结构,那么必然有形成二聚体的可能,只不过根据你loop和stem的序列长短有难易区别而已.而且底物是必须要变性的,所以保险起见都是把引物加入到底物中,然后一起变性,然后退火.
实验之前预先把它变成茎环没有意义,而且也不能保证确定能形成茎环.必然会同时形成引物二聚体的形式,会影响实验效率.
欢迎讨论,祝实验顺利=)