设计引物时哪一些原则可以稍微忽略一些,引物长度必须是3的倍数吗?

Question

设计引物时哪一些原则可以稍微忽略一些,引物长度必须是3的倍数吗?

Answer 1

引物长度不重要.其实,最重要的是引物与目标序列完全匹配就可以了.明显的发夹结构及引物自身和引物相互间的连接键能要注意一下,其他都没有什么.多试试,楼主一定能成功的.
以下是我认为比较重要的地方,
1、引物长度
一般引物长度为18~30碱基.总的说来,决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度.有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度.引物长度也不重要,我们经常做很长的引物也能用.不过,引物长了,合成方面更容易产生合成错误.当然,一般引物里面15-20个碱基匹配上就可以了.
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
2、避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往有难度.
3、引物末端
引物3’端是延伸开始的地方,因此要防止错配就从这里开始.3’端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.
4、引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构,这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.两引物之间不应该存在互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一般情况下,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.