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如果让你来设计一段已知dna序列的上下游引物,应该注意哪些方面
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如果让你来设计一段已知dna序列的上下游引物,应该注意哪些方面
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答案和解析
引物设计原则：
1、长度：15—30bp,其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性.
2、G十c含量：应在45%一55%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度.引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T).
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基.尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发.
4、引物自身：不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构.
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠.
1、长度：15—30bp,其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性.
2、G十c含量：应在45%一55%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度.引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T).
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基.尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发.
4、引物自身：不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构.
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠.
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