追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p

Question

追问引物设计
第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是pCMV-N-FLAG标签真核表达载体,不知道您用过没有,想问一下,双酶切连接之后,目的片段之前的那一段多克隆位点序列会不会翻译成多肽,会影响目的蛋白的表达吗?

Answer 1

第一次PCR产物不要做任何处理,直接吸取1微升做第二轮PCR的模板.第二轮PCR过后再跑胶回收你的目的条带.
外引物不在你的目的基因上,而在你的目的基因两侧.所以你设计外引物时是从一个很宽泛的范围内寻找最优的引物对,基本上不会遇到啥问题.而内引物,就是你目的片段的两端.
因为经过了第一次PCR,你的模板已经得到了一定的扩增纯化,所以就算内引物设计得很糟糕也没事,一端GC含量高,无非就是最后扩增效率低点,或是引物二聚体多些,但产物特异性还是能保证的.
如果真的因为内引物出了岔子（其实我遇到过这样的事）,那你就设计两对外引物,一对内引物.从外往里P,这样就能保证用到内引物时,模板真的很单一了,绝对万无一失.
至于担心之前的多克隆位点序列翻译成多肽,这完全不是个问题.这些位点的确会翻译成多肽,但这些多肽是无规卷曲,不会影响下游蛋白的构象.事实上,为了提高接下来亲和层析的效率,蛋白上所加的tag需要和目的蛋白有一定的距离,这样才能让tag和柱材上的配体结合时不受目的蛋白空间位阻的影响.
您明白了吗?欢迎追问!