基因工程育种中，常用两种限制酶同时切割目的基因和载体，以保证重组DNA序列的唯一性，利用带有两种标记基因的质粒构建的重组质粒，便于筛选导入重组质粒的受体细胞．如下图所示为

Question

基因工程育种中，常用两种限制酶同时切割目的基因和载体，以保证重组DNA序列的唯一性，利用带有两种标记基因的质粒构建的重组质粒，便于筛选导入重组质粒的受体细胞．如下图所示为转基因抗虫棉的培育过程示意图，请据图回答下列问题：

注：HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ为三种限制性内切酶．影印培养法：是一种类似“盖章”的接种方法，使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落．
（1）如果将抗虫基因直接导入棉花细胞，一般情况下，棉花不会具有抗虫特性，原因是抗虫基因在棉花细胞中不能___，因此需要构建基因表达载体．
（2）在构建重组质粒时，应选用___和___两种限制酶对目的基因和质粒进行切割，以保证重组DNA的准确连接．
（3）图中运用影印培养法检测基因表达载体中是否导入了农杆菌，以便于筛选导入目的基因的受体细胞．培养基除了含有细菌生长繁殖必需的营养成分外，培养基A和B还应分别添加___、___．筛选的结果表明，含有目的基因的是___菌落中的细菌．为了确定抗虫棉是否培育成功，既要用放射性同位素标记___作探针进行分子杂交检测，又要用___从个体水平鉴定棉花植株的抗虫特性．
（4）将转入抗虫基因的棉花细胞培育成完整的植株需要用植物组织培养技术，愈伤___进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加___．
（5）科学家通常将目的基因导入到植物细胞的___中，是为了防止转基因作物的目的基因通过花粉传递给近缘物种．

Answer 1

（1）如果将抗虫基因直接导入棉花细胞，由于该基因上缺少复制原点以及启动子和终止子，因此在棉花细胞中不能稳定存在并复制和表达，因此一般情况下，棉花不会具有抗虫特性，需要构建基因表达载体．
（2）质粒和含有目的基因的外源DNA分子上都含有SalI、Hindm、BamHI三种限制酶切割位点，其中BamHI的切割位点位于目的基因上，用该酶切割会破坏目的基因；若只用SalI一种限制酶切割可能会导致目的基因与运载体反向连接；因此在构建重组质粒时，应选用SalI和HindIII两种限制酶对质粒和抗盐基因进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性．
（3）用SalI和HindIII两种限制酶对质粒进行切割时，会破会四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素，含目的基因的是4和6菌落中的细菌．探针是指用放射性同位素标记的目的基因（抗盐基因）．除了从分子水平上进行检测，还可以从个体水平上进行鉴定，即用一定浓度的盐水浇灌烟草植株来鉴定烟草的耐盐性．
（4）将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用采用植物组织培养技术，先经过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再经过增殖和分化形成完整的植株．此过程除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素（生长素和细胞分裂素）．
（5）科学家通常将目的基因导入到植物细胞的线粒体（或叶绿体）

中，这样植物产生的花粉粒中将不含目的基因，能够防止转基因作物的目的基因通过花粉传递给近缘物种．
故答案为：
（1）稳定存在并复制和表达
（2）Sal I     Hind III
（3）氨苄青霉素     四环素    4和6     抗虫基因的DNA片段  抗虫的接种实验
（4）再分化   植物激素（生长素和细胞分裂素）
（5）线粒体（或叶绿体）