如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的而不重复标注．请回答下列问题．限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ识

Question

如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的而不重复标注．请回答下列问题．

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
识别序列及切割位点

（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用限制酶为___，酶切后的载体和目的基因片段通过___酶作用后获得重组质粒．
（2）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是___，这两种酶___（选填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开连接的部位，原因是___．
（3）若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得___种大小不同的DNA片段．
（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加___，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中___．

Answer 1

（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，且会破坏质粒中的两个抗性基因；Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，也会破坏质粒中的两个抗性基因，不利于后期的筛选，所以应选用限制酶为BclⅠ和HindⅢ．选择的限制酶应在目的基因两侧切割，切割后的DNA片段用DNA连接酶连接．
（2）BamHⅠ酶切得DNA末端与BclⅠ酶切得DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是黏性末端相同（即同尾酶），但是被DNA连接酶连接后便不能再被这两种限制酶切割了，因为不满足两种限制酶对识别序列的特异性要求．
（3）根据BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位点，Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段．
（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素（根据标记基因的种类），平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物应具有成对反向的特点．
故答案为：
（1）BclⅠ和HindⅢDNA连接
（2）黏性末端相同    都不能    核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ识别切割
（3）7
（4）四环素    引物甲和引物丙