为什么同种限制酶切割形成的末端相同时目的基因与质粒会反向连接,为什么会有反向连接这种情况.目的基因与质粒不就是本应该用同一种限制酶切割的吗?

Question

为什么同种限制酶切割形成的末端相同时目的基因与质粒会反向连接,为什么会有反向连接这种情况.目的基因与质粒不就是本应该用同一种限制酶切割的吗?

Answer 1

限制酶的识别位点大多是反向对称的,如果只用用同种酶切,所得片段的2端序列相同,在连接时,是随机连接,不仅会出现反向连接,而且会出现片段串联.
在分子克隆实验中,我们会用两种酶分别切目的基因和质粒的上下游,这样就保证了目的片段和质粒片段在连接时的方向性,如上游都用EcoR I,下游都用BamH.
你所理解的“目的基因与质粒不就是本应该用同一种限制酶切割”,指的就是两者上游同用一种,下游又同用另一种,而不是指上下游都用同一种酶切.
除非是某些特殊情况,不得不用一种酶切上下游,这样会出现大量的反向连接,连接后,需要多挑些克隆鉴定.
个人见解,仅供参考,祝好!