融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制合成的蛋白质．人的表皮生长因子受体（EGFR）是影响癌症发生发展的重要因素，它在肺癌、脑肿瘤等实

Question

融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制合成的蛋白质．人的表皮生长因子受体（EGFR）是影响癌症发生发展的重要因素，它在肺癌、脑肿瘤等实体瘤中均有大量表达．天花粉蛋白（TCS）是重要天花粉的有效成分，具有抗肿瘤作用．下图是通过基因工程方法将人表皮生长因子基因（EGF）和TCS基因连接起来，利用大肠杆菌生成人表皮生长因子-天花粉蛋白融合蛋白的过程示意图．请回答：

（1）为了建立含有EGF的cDNA文库，应从健康人体的___细胞中提取总mRNA，通过___法合成cDNA．从cDNA文库中提取的EGF的长度比从基因组文库中提取的EGF___．利用___技术可以大量扩增EGF，该技术所利用的原理是___．
（2）在①过程中，应使用的限制酶是___，在融合蛋白基因的首端还应
插入___，它是___识别和结合的位点．
（3）在②过程中，首先用___处理大肠杆菌，使其转变为___细胞．
（4）应用____技术可检测大肠杆菌是否表达出融合蛋白．
（5）单纯使用天花粉蛋白治疗癌症疗效甚微，而人表皮生长因子--天花粉蛋白融合蛋白疗效显著，其原因是___．
（6）某同学为了筛选插入目的基因的表达载体，将处理过的载体分别置于含有氨苄青霉素和四环素的培养基上培养，观察其增殖和表达情况．此设计方案是否合理，___请说明理由___．

Answer 1

（1）EGF基因只在表皮细胞中表达，即只有表皮细胞中含有相应的mRNA，因此要获得EGF基因，应从健康人体的表皮细胞中提取其mRNA，通过逆转录法合成．通过逆转录法合成的EGF基因不含内含子、启动子等结构，因此其长度比从基因组文库中获取的EGF基因短．利用PCR技术可以大量扩增EGF，该技术所利用的原理是DNA双链复制．
（2）EGF基因两侧的限制酶是BamHI和Sph I，因此在①过程中，应使用的限制酶是BamHI和SphI，而且在融合蛋白基因的首端还应插入启动子．
（3）在②过程中，首先用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其转变为感受态细胞．
（4）应用抗原--抗体杂交_技术可检测大肠杆菌是否表达出融合蛋白．
（5）人表皮生长因子能与肿瘤细胞表面的受体特异性结合，从而使天花粉蛋白定向地作用于肿瘤细胞，因此单纯使用天花粉蛋白治疗癌症疗效甚微，而人表皮生长因子--天花粉蛋白融合蛋白疗效显著．
（6）由于表达载体不能在培养基上增殖和表达，只有导入大肠杆菌，才能增殖和表达，因此不能采用该方案．
故答案为：
（1）表皮    反（逆）转录    短   PCR     DNA双链复制
（2）BamHⅠ和SphⅠ启动子       RNA聚合酶
（3）Ca²⁺      感受态
（4）抗原--抗体杂交     
（5）人表皮生长因子能与肿瘤细胞表面的受体（EGFR）特异性结合，从而使天花粉蛋白定向的作用于肿瘤细胞
（6）不合理     表达载体不能在培养基上增殖和表达，只有导入大肠杆菌，才能增殖和表达