如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图．图1中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因．图中EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括

Question

如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图．图1中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因．图中EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离．回答下列问题．

（1）图中三种质粒中不能作为目的基因运载体的是___，理由是___、___．
（2）在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用___酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测．若电泳图谱中出现长度为1.1kb和5.6kb，或者___kb和___kb的片段，则可判断该重组质粒已与目的基因重组成功．
（3）为研究目的基因D的功能，研究人员用图2所示的引物组合分别扩增D基因的D₁片段、D₃片段（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）．
注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x，y片段分别与N基因两端互补配对
①用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增后，得到的绝大部分DNA片段是图3中的___．
②将大量N基因片段与扩增得到的D₁片段、D₃片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是___（填“D₁-N”或“D₁-D₃一N”或“D₃-N”或“D₁-N-D₃”）．

Answer 1

（1）图中质粒A缺少标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自主复制．因此，能作为目的基因运载体最理想的质粒是B．
（2）分析图解可知，在目的基因上存在EcoRⅠ酶的切割位点，因此在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用该酶切重组质粒．目的基因和质粒B形成的重组质粒长度为2.7-0.1+（4.0-1.0）=5.6kb（质粒且切割后形成的大的片段+切割目的基因时形成的大片段）、0.1+1.0=1.1kb（质粒且切割后形成的小的片段+切割目的基因时形成的小片段）或2.7-0.1+1.0=3.6（质粒且切割后形成的大的片段+切割目的基因时形成的小片段）、0.1+3.0=3.6（质粒且切割后形成的小的片段+切割目的基因时形成的大片段）．
（3）①根据题图分析，用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增扩增的是D1片段，以引物Ⅱ所在的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的X片段也被作为模板合成子链，因此得到的绝大部分DNA片段是图3中的d．
②由于引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段都能与N基因两条链上的碱基进行互补配对，因此将大量N基因片段与扩增得到的D₁片段、D₃片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是D₁-N-D₃，A₂基因被敲除．
故答案为：
（1）质粒A、质粒C　（质粒A）缺少标记基因      （质粒C）复制原点会被限制酶切割
（2）EcoRⅠ3.1　3.6
（3）①d　②D₁-N-D₃