请分析回答下列有关基因工程问题胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一．图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程（融合蛋

Question

请分析回答下列有关基因工程问题
胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一． 图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工  程菌生产人胰岛素的基本流程（融合蛋白  A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白）．

（1）图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是___．
（2）图1中启动子是___ 酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是___．
（3）构建基因表达载体时必需的工具酶有___．
（4）β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于___．
（5）溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β-半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为___．
（6）根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量．你的推测结果是___，理由是___．
（7）如果图1所示的载体可被A、B、C三种限制性内切酶同时切割．单独A切割得一条长链，单独B切也得一条长链，A和C同时切割得2个500bp和1个2666bp片段，B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段．若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度为___，C的两个切割位点与A点的最短距离分别为___、___．
（8）如限制酶SmaI能识别如图3的「5‘-CCCGGG-3’」6个碱基序列，并在中央（图中箭头位置）切断DNA．则用限制酶SmaI处理如图的线状双链DNA时，请以箭头标出切割位置．

Answer 1

（1）根据题意和图示分析可知：图1基因表达载体中已有目的基因、启动子和标记基因，所以没有标注出来的基本结构是终止子．
（2）图1中启动子是RNA聚合酶酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达即转录过程；氨苄青霉素抗性基因的作用是作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来．
（3）构建基因表达载体的过程中，必须用相同的限制酶切割（含目的基因的外源DNA分子）和运载体，以产生相同的黏性末端，再加入DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子．
（4）β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，这样可以防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解．
（5）溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，由于β-半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸，而胰岛素的A、B链中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β-半乳糖苷酸被切成多个肽段．
（6）由于一个肽链中至少有一个游离的氨基和一个游离的羧基，在肽链内部的R基中可能也有氨基和羧基，而胰岛素含有A链和B链，所以每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量至少是2个．
（7）分析题意可知，限制酶A和B在质粒上均只含有一个切割位点，限制酶C在质粒上有2个切割位点．由于B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段，说明限制酶B的切点在限制酶C的两个短距离的切点之间，因此若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度=500+250=750bp，则画图可知C的两个切割位点与A点的最短距离分别为500bp、1000bp．
（8）分析图解可知，限制酶SmaI能识别如图3的「5‘-CCCGGG-3’」6个碱基序列，并在中央切断DNA形成的平末端，因此它的切割位点为C和G之间．

故答案为：
（1）终止子   
（2）RNA聚合    作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来
（3）限制酶和DNA连接酶
（4）防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解
（5）β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸
（6）至少2个    两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸的R基中可能还含有游离的氨基
（7）750bp     500bp     1000bp 
（8）