对棉纤维基因GhRACK1的正常启动子P进行改造，获得了P1、P2、P3、P4缺失体．科研人员对正常启动子P及其4种缺失体（P1-P4）进行了实验研究．（1）首先利用PCR技术扩增正常启动子P，方法如图1

Question

对棉纤维基因GhRACK1的正常启动子P进行改造，获得了P1、P2、P3、P4缺失体．科研人员对正常启动子P及其4种缺失体（P1-P4）进行了实验研究．
（1）首先利用PCR技术扩增正常启动子P，方法如图1．

①不能直接根据片段Ⅰ扩增出正常启动子P，因为___．
②利用___酶处理使片段Ⅰ成为环状DNA．
③将环状DNA用___酶处理，得到片段Ⅱ．欲扩增出正常启动子P，需选用的引物组合为___．
（2）利用有关酶对正常启动子P进行切割，得到不同程度缺失体（P1-P4），图2表示正常启动子P缺失示意图．

（3）利用正常启动子P及其4种缺失体（P1-P4）分别构建了基因表达盒，如图3所示．

（4）再将5种基因表达盒分别转入相同质粒，构建相应的植物表达载体．然后将其导入农杆菌，最后导入烟草细胞中．用含有___的培养基对烟草细胞进行筛选，分别获得了含有正常启动子P及其4种缺失体（P1-P4）的转基因烟草．将植物组织浸入适量___溶液中，观察烟草细胞gus基因是否表达，实验结果如下表．

	根	叶	花粉
正常启动子P	幼根+根毛+	-	-
P1	+	+	+
P2	+	+	+
P3	+	+	+
P4	+	+	+

有蓝色：+无蓝色：-
如果烟草细胞中gus基因成功表达，则细胞呈现蓝色．实验结果表明___．
与P1-P4的实验结果相比，说明正常启动子P发挥不同功能的关键序列位于图2的___．（填字母）

Answer 1

（1）①利用PCR技术扩增DNA的前提条件是要有已知核苷酸序列的目的基因，但正常启动子P左侧序列未知，因此不能直接根据片段Ⅰ扩增出正常启动子P．
②根据图1中环状DNA分子中的酶切位点可知，要得到环状DNA分子时，首先利用Bgl II酶切割片段Ⅰ，再用DNA连接酶处理使片段Ⅰ成为环状DNA．
③根据图1可知，将环状DNA用Msc I酶处理，得到片段Ⅱ． PCRPCR反应中是从引物的3‘端开始合成新DNA链的，因此欲扩增出正常启动子P，需选用的引物组合为C和B．
（4）根据图3可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此导入烟草细胞中后，用含有卡那霉素的培养基对烟草细胞进行筛选，分别获得了含有正常启动子P及其4种缺失体（P1-P4）的转基因烟草．由于gus基因表达产物可将X-Gluc水解生成蓝色产物，因此将植物组织浸入适量X-Gluc溶液中，观察烟草细胞gus基因是否表达．实验结果表明正常启动子P驱动gus基因在幼根及根毛中特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达．与P1-P4的实验结果相比，说明正常启动子P发挥不同功能的关键序列位于图2的M、Q．
故答案为：
（1）正常启动子P左侧序列未知         Bgl II和DNA连接       Msc I     C和B
（4）卡那霉素      X-Gluc       正常启动子P驱动gus基因在幼根及根毛中特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达      M、Q