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重组DNA转化大肠杆菌化学法转化实验影响转化率的关键因素有哪些?
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重组DNA转化大肠杆菌化学法转化实验影响转化率的关键因素有哪些?
▼优质解答
答案和解析
影响转化率的关键因素：
①生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态.转化时菌浓度应控制在不超过107／ml.
②CaCl2法0℃放置时间的影响：细菌经0℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加,24h达到最高,之后转化率逐渐下降.
③化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上,联合其他二价金属离子(如Mn2+,CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化率提高100～1000倍.
④质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现,从2kb到3．2kb的转化效率上升,此后到66kb转化效率线性下降.同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75％,线型质粒的转化率更要低100～1000倍,线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因.
⑤菌株基因型recA+与recA-的影响：recA基因是rec系列中最主要的基因,编码同源重组蛋白.考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细菌染色体DNA整合的可能,因而,通常在转化实验中都选用recA-菌株作为宿主菌.
①生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态.转化时菌浓度应控制在不超过107／ml.
②CaCl2法0℃放置时间的影响：细菌经0℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加,24h达到最高,之后转化率逐渐下降.
③化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上,联合其他二价金属离子(如Mn2+,CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化率提高100～1000倍.
④质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现,从2kb到3．2kb的转化效率上升,此后到66kb转化效率线性下降.同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75％,线型质粒的转化率更要低100～1000倍,线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因.
⑤菌株基因型recA+与recA-的影响：recA基因是rec系列中最主要的基因,编码同源重组蛋白.考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细菌染色体DNA整合的可能,因而,通常在转化实验中都选用recA-菌株作为宿主菌.
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