什么是点种法

Question

什么是点种法

Answer 1

菌种选育的目的是改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求.
一、自然选育：从自然界分离获得菌种,根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种
一从自然界分离获得菌种
1. 采样：取地面5～15 cm的土壤.
2. 增殖培养：(富集培养enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件,使所需菌株大量繁殖,从而有利于分离它们.
方法：
（1）控制培养基的营养成分：如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖.
（2）控制培养条件：
细菌,放线菌：pH7.0～7.5 35～37℃
霉菌,酵母菌：pH 4.5～6.0 20～28℃
（3）抑制不需要的菌类
分离细菌：加入丙酸钠以抑制霉菌,酵母
分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧
3. 纯种分离
（1）划线法：简单、快速.
（2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀,获得纯种的几率大,适合分离具有蔓延性的微生物.
固体培养基四区划法接种法
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
步骤三
以接种针轻触菌落,使接种针上沾有细菌.
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上.此为第一菌区 .
步骤六
重复第一步骤,将接种针以火焰灭菌法灭菌,然后轻触琼脂无菌处冷却.
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二区,如右上图.
步骤八
重复第六以及第七步骤,由第七步骤的第二区中划出第三区,如右上图.
步骤九
重复第六以及第七步骤,由第八步骤的第三区中划出第四区,划满剩下的空间.完成后的营养平板,如右上图.
步骤十
在营养平板上贴好标签,标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称.
固体培养基的稀释涂抹接种法
【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目.
需要使用的仪器——震荡机
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管,将试管口过火灭菌.将菌液置入,此时试管须做记号为第一次稀释.
将试管于震荡机上,使菌液混合均匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL,加入另一个新的含9mL无菌水的试管中.重复此步骤直至所需要的稀释浓度.
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液,置入准备好的无菌琼脂内.
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中,引起燃烧）
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来,将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目,再依照稀释倍数推算出菌液浓度.
4.生产性能的测定：纯种分离后得到菌株数量大,不可能一一进行性能测试.一般采用两步法：初筛,复筛.从而获得较好菌株（野生型菌株）（区别于变异菌株）.
初筛：以量为主
复筛：以质为主
二从自发突变体中获得菌株
微生物可遗传的特性发生变化称变异,又称突变,是微生物产生变种的根源,也是育种的基础.自然突变是指在自然条件下出现的基因变化.但自发突变的频率较低,往往不能符合工业生产的要求.因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率.
5.6 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选.尤其是在诱变育种工作中,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.经诱变处理后,突变细胞只占存活细胞的百分之几,而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数.要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞,就象是大海捞针,工作量很大.简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键. 为了花费最少的工作量,在最短的时间内取得最大的筛选成效,就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段.因为诱变育种中的筛选工作最复杂,所以,本节主要讨论诱变育种的筛选方法,这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴.
5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中,为了提高筛选效率,往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行.初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株,把生产性状类似的菌株尽量保留下来,使优良菌种不致于漏网.因此,初筛工作以量为主,测定的精确性还在其次.初筛的手段应尽可能快速、简单.复筛的目的是确认符合生产要求的菌株,所以,复筛步骤以质为主,应精确测定每个菌株的生产指标.
5.6.2 菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求,对于初筛,要力求快速、简便,对于复筛,应该做到精确,测得的数据要能够反映将来的生产水平.
5.6.2.1 从菌体形态变异分析 有时,有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性,这就能很容易地将变异菌株筛选出来.尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性,但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化.当然,这种鉴别方法只能用于初筛.有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落,发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米）,凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色,凡浅黄或白色者皆属低产菌株.又如,在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中,曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高,而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中,却发现菌落的紫色加深者产量反而下降.
5.6.2.2 平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化.具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等,见图5.6.1.这些方法较粗放,一般只能定性或半定量用,常只用于初筛,但它们可以大大提高筛选的效率.它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养,尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别,有时会造成两者的结果不一致. 图 5.6.1 平皿快速检测法示意图 平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散,形成单菌落,以避免多菌落混杂一起,引起"形态"大小测定的偏差.
1) 纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中,用牛津杯架空,下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿,将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上,保温培养形成分散的单菌落,菌落周围将会产生对应的颜色变化.从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状.指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物.
2) 变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中,进行待筛选菌悬液的单菌落培养,或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面,在菌落周围形成变色圈.如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液,使其呈单菌落,然后喷上稀碘液,发生显色反应.变色圈越大,说明菌落产酶的能力越强.而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况.
3) 透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养基背景.将待筛选在菌落周围就会形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力. 在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小.
4) 生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌,若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下,能合成该营养物,或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物,那么,在这些菌的周围就会有工具菌生长,形成环绕菌落生长的生长圈. 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌.工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株.
5) 抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质,从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈.例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出,以避免其它因素干扰,移入无培养基平皿,继续培养4-5天,使抑制物积累,此时的抑制物难以渗透到其它地方,再将其移入涂布有工具菌的平板,每个琼脂块中心间隔距离为2厘米,培养过夜后,即会出现抑菌圈.抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低.该法常用于抗生素产生菌的筛选,工具菌常是抗生素敏感菌.