为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d．现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，统计母本植株的结实率，结果如表所示．

Question

为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d．现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，统计母本植株的结实率，结果如表所示．

杂交编号	亲本组合	结实数/授粉的小花数	结实率
①	♀DD♂dd	(16)/(158)	10%
②	♀dd♂DD	(77)/(154)	50%
③	♀DD♂DD	(71)/(141)	50%

（1）表中数据表明，D基因失活使___配子育性降低．为确定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可将___作为目的基因，与载体连接后，导入到___（填“野生”或“突变”）植株的幼芽经过___形成的愈伤组织中，最后观察转基因水稻配子育性是否得到恢复．
（2）用___观察并比较野生植株和突变植株的配子形成，发现D基因失活不影响二者的___分裂．
（3）进一步研究表明，配子育性降低是因为D基因失活直接导致配子本身受精能力下降．若让杂交①的F₁给杂交②的F₁授粉，预期结实率为___，所获得的F₂植株的基因型及比例为___．
（4）为验证F₂植株基因型及比例，研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图所示：

随机选取F₂植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）．若___，则相应植株的基因型为Dd；同理可判断其他基因型，进而统计各基因型比例．
（5）研究表明D基因表达产物（D蛋白）含有WD40（氨基酸序列），而通常含有WD40的蛋白都定位在细胞核内．为探究D蛋白是否为核蛋白，研究者将D基因与黄色荧光蛋白基因融合；同时将已知的核蛋白基因与蓝色荧光蛋白基因融合．再将两种融合基因导入植物原生质体表达系统，如果___，则表明D蛋白是核蛋白．

Answer 1

（1）②③两组中雄性个体的基因型均为DD，不论雌性个体的基因型是什么，后代结实率均为50%，说明D基因失活与雌配子的育性无关；又已知①中雄性个体的基因型为dd（D基因失活），后代结实率只有10%，说明D基因失活使雄配子育性降低．愈伤组织是外植体脱分化形成的．为确定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可将D基因作为目的基因，与载体连接后，导入到突变植株的愈伤组织中，最后观察转基因水稻配子育性是否得到恢复．
（2）配子是减数分裂形成的，而减数分裂过程可用显微镜进行观察．
（3）在第（1）小问中：DD做父本，结实率都为50%，可以得出D的雄配子中可育的占(1)/(2)；dd做父本，结实率为10%，可以得出d的雄配子中可育的占(1)/(10)．若让杂交①的F₁（Dd）给杂交②的F₁（Dd）授粉，则结实率为（10%+50%）÷2=30%．若让杂交①的F₁（Dd）给杂交②的F₁（Dd）授粉，两者基因型都为Dd，产生的配子都为D：d=1：1．但是雄配子的可育性D是d的5倍，所以可育的雄配子D：d=5：1，可育的雌配子D：d=1：1．那么就会有如下的杂交结果：

（4）
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ引物的结合位点如上图所示，根据题中信息“完整的T-DNA过大，不能完成PCR”，且d基因的产生是T-DNA插入了D基因内部，所以如果以D基因为模板，Ⅱ、Ⅲ引物组合可以扩增出一种片段，以突变后的D基因（d基因）为模板，Ⅰ、Ⅲ引物组合可以扩增出另外一种片段．如果某植株的基因型是Dd，则从其体内提取出来的作为扩增的模板就有两种，两种引物组合都能够进行扩增．
（5）从题中信息可以看到有一个对照实验：对照组：已知的核蛋白基因+蓝色荧光蛋白基因→植物原生质体表达系统；实验组：D蛋白基因+黄色荧光蛋白基因→植物原生质体表达系统．所以，如果两种颜色的荧光都出现在细胞核内，就表明D蛋白是核蛋白．
故答案为：
（1）雄    D基因    突变     脱分化
（2）显微镜    减数
（3）30%    DD：Dd：dd=5：6：1
（4）两种引物组合均可完成扩增
（5）两种荧光的定位相同