降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等．人的降钙素活性很低，半衰期较短．某科学机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，从预期新型降钙素的功能出发，推

Question

降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等．人的降钙素活性很低，半衰期较短．某科学机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA，过程如如图所示．在此过程中发现，合成较长的核苷酸单链易产生缺失碱基的现象．分析回答下列问题：

（1）上述制备该新型降钙素，运用的现代生物工程技术是___．
（2）Klenow酶是一种___酶，合成的双链DNA有___个碱基对．
（3）获得的双链DNA经EcoRⅠ（识别序列和切割位点-G^↓AATTC-）和BamHⅠ（识别序列和切割位点-G^↓GATCC-）双酶切后插入到大肠杆菌质粒中，筛选含重组质粒的大肠杆菌并进行DNA测序验证．
①设计EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的目的是___．
②双酶切后DNA插入到大肠杆菌质粒中能得到___种重组质粒．
③要进行重组质粒的鉴定和选择，需要大肠杆菌质粒中含有___．
（4）经DNA测序表明，最初获得的多个重组质粒，均未发现完全正确的基因序列，可能的原因是___．

Answer 1

（1）制备该新型降钙素时，先从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，之后改造DNA分子，最后生成新型降钙素，这是蛋白质工程的具体过程．
（2）图示过程是以DNA一条链为模板，利用4种游离的脱氧核糖核苷酸为原料来合成双链DNA，此过程所用的酶是DNA聚合酶．合成的双链DNA含有的碱基对有（72-18）×2+18=126个碱基对．
（3）①限制酶具有特异性，一种限制酶只识别一定的脱氧核苷酸序列，切割特定的位点．为了防止目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接或保证目的基因和载体定向连接，将获得的双链DNA用EcoRI和BamHI进行双酶切．
②质粒被双酶切后会形成2个DNA片段，因此DNA插入到大肠杆菌质粒中能得到2种重组质粒．
③重组质粒中含有标记基因，标记基因可以鉴别受体细胞中是否含有目的基因．
（4）由图可知，在合成DNA双链时，如果合成的核苷酸单链较长，容易发生缺失碱基的现象，这样可能会引起最初获得的多个重组质粒均未发现完全正确的基因序列．
故答案为：
（1）蛋白质工程
（2）DNA聚合酶     126
（3）①保证目的基因和载体定向连接（或防止目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接
②2
③标记基因
（4）合成的核苷酸单链仍较长，产生缺失碱基的现象