目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示．请回答以下基因工程技术操作中的问

Question

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示．请回答以下基因工程技术操作中的问题：

（1）构建人工质粒时不光要有抗性基因、复制原点等，还应该具备RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动目的基因转录，该部位称为______．
（2）获取目的基因后可以用PCR技术扩增．PCR仪器可以模拟DNA双链在体内的复制，所不同的是，PCR过程中的DNA聚合酶（taq酶）的______性比体内的DNA聚合酶强；而在PCR过程中通过加热（90-95℃）达到的结果，和体内DNA复制时所需______酶的作用相同．
（3）受体细胞不同，导入目的基因的方法也不同．如受体细胞是植物细胞，可选用
______转化法；如受体细胞是细菌，则先用Ca²⁺处理，将其转化为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为______细胞．将人胰岛素基因导入大肠杆菌内且成功表达后，提取的产物还需进行体外加工和改良，因为大肠杆菌缺乏______（细胞器），无法加工形成胰岛素．
（4）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经限制酶BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理后得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复
______键，成功地获得了重组质粒，这说明限制酶BamHⅠ和限制酶BglⅡ的酶切产物具有______．
（5）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落．再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）．与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是______，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______质粒．

Answer 1

（1）基因表达载体的组成包括标记基因（如抗性基因）、复制原点、启动子、终止子和目的基因等，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动目的基因转录．
（2）PCR过程是在较高环境中进行的，需要热稳定DNA聚合酶（taq酶）；在PCR过程中通过加热（90-95℃）达到的结果，和体内DNA复制时所需解旋酶的作用相同．
（3）将目的基因导入植物细胞常用感受态细胞法；将目的基因导入微生物细胞，常用感受体细胞法，即先用Ca²⁺处理，将其转化为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞．将人胰岛素基因导入大肠杆菌内且成功表达后，提取的产物还需进行体外加工和改良，因为大肠杆菌是原核生物，其细胞中缺乏内质网、高尔基体，无法加工形成胰岛素．
（4）DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；经限制酶BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理后得到的目的基因可以形成重组质粒，说明限制酶BamHⅠ和限制酶BglⅡ的酶切产物具有相同末端．
（5）图二中的菌落能抗氨苄青霉素，将灭菌绒布按到图二中培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到图三含四环素的培养基上培养，仍能生长的也能抗四环素，空圈为只能抗氨苄青霉素而不能抗四环素的．因此，图三结果显示，多数大肠杆菌既能抗氨苄青霉素，又能抗四环素，说明导入的是pBR322质粒，而不是重组质粒（重组质粒的四环素抗性基因被切断，不能表达，因此含重组质粒的大肠杆菌抗氨苄青霉素）．
故答案为：
（1）启动子     
（2）热稳定     解旋酶
（3）农杆菌     感受态        内质网、高尔基体
（4）磷酸二酯       相同末端
（5）抗氨苄青霉素不抗四环素（或只抗氨苄青霉素）     pBR322