（2014•德州一模）赖氨酸是人体必需氨基酸之一，可促进人体发育、增强免疫力．乙图为赖氨酸转基因克隆牛的培育流程，其中字母表示相应的操作过程．请回答：（1）构建基因表达载体

Question

（2014•德州一模）赖氨酸是人体必需氨基酸之一，可促进人体发育、增强免疫力．乙图为赖氨酸转基因克隆牛的培育流程，其中字母表示相应的操作过程．请回答：

（1）构建基因表达载体的过程如甲图所示，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶，该过程中所使用的限制酶是______和______，除限制酶外，该过程还需要的工具酶有______．基因表达载体除图示结构外，还应含有______和______终止子等结构．
（2）为了获得较多的卵母细胞需要对供体注射______，卵母细胞要培养至______时期，才具备受精能力．
（3）胚胎成纤维细胞在培养过程中会出现______和______现象，分瓶时需用______  处理以得到细胞悬液，进而进行______培养使细胞增殖．
（4）图乙中a、b过程利用的主要生物技术有______和______．

Answer 1

（1）含抗病基因的DNA含有限制酶PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ的切割位点，但限制酶SmaⅠ的切割位点位于抗病基因上，对SmaⅠ位点进行切割破坏了抗病基因的结构，所以要获得抗病基因，不能否用限制酶SmaⅠ对图中对应的位点进行切割．要获得含抗病基因的重组质粒，应选用PstⅠ、EcoRⅠ限制酶切割质粒．重组质粒时，还需要DNA连接酶连接目的基因和质粒切口．基因表达载体包括目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点．（2）卵母细胞的采集主要方法是：用促性腺激素处理，使其超数排卵．采集的卵母细胞，需要培养到减数第二次分裂中期后，才能与获能的精子受精．
（3）动物细胞培养的过程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→培养时，悬液中的细胞会很快贴附在瓶壁上，细胞表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养．
（4）图乙中a过程利用DNA拼接技术（基因工程）获取含有目的基因的胚胎成纤维细胞，b过程是通过动物细胞核移植技术培养克隆动物．
故答案为：
（1）PstI；EcoRI（位置可颠倒）；DNA连接酶；启动子；
（2）促性腺激素；减数第二次分裂中期；
（3）接触抑制；贴壁生长（两者顺序可颠倒）；胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）；传代；
（4）DNA拼接技术（基因工程）；动物细胞核移植技术．