大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的运载体．某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，

Question

大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的运载体．某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．如图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程．请分析并回答：

（1）已获得的目的基因可利用______技术进行扩增．
（2）目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复______键．
（3）将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是______；大肠杆菌需事先用Ca²⁺进行处理，目的是______．
（4）将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质和生长因子，还应加入IPTG、X-gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出含______的大肠杆菌．
（5）若观察到培养基上出现______色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒．如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是无论大肠杆菌是否导入重组质粒，均会呈现______色菌落．

Answer 1

（1）PCR技术能在短时间内大量扩增目的基因，所以已获得的目的基因可利用PCR技术进行扩增．
（2）DNA连接酶连接形成的是磷酸二酯键．
（3）将试管I中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是使目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达，即进行转化；大肠杆菌需事先用Ca²⁺进行处理，增大细胞壁的通透性，使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态．
（4）由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此导入质粒的大肠杆菌能抗氨苄青霉素，所以培养基中加入氨苄青霉素的作用是筛选出导入pUC18质粒的大肠杆菌．
（5）重组质粒上的LacZ基因被破坏，不能产生β一半乳糖苷酶，若大肠杆菌中已成功导入了重组质粒，则其在含有IPTG和X-gal的培养基中形成白色菌落．如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则无论大肠杆菌是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落．
故答案为：
（1）PCR
（2）磷酸二酯
（3）进行转化      使大肠杆菌细胞处于感受态
（4）导入pUC18质粒
（5）白      蓝