粮食问题一直困扰着人类．为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注．我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系．请据图回答下列问题：表2几

Question

粮食问题一直困扰着人类．为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注．我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系．请据图回答下列问题：

表2　几种限制酶识别序列及切割位点表

限制酶	NaⅠ	EoKⅠ	PstⅠ	ScoⅠ
切割位点	↓  ACCT TCCA ↑	↓   CAATTC  CTTAAC ↑	↓   CTDCAC   CACCTC ↑	↓  CCCCCC CCCCCC ↑

（1）如果要将耐盐碱基因和质粒重组，必须对基因进行修饰和改造：在基因两侧的A和B位置分别加入______限制酶识别序列，这样才有利于目的基因和质粒定向连接．
（2）过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物Ⅰ和引物Ⅱ等物质，若共用了引物Ⅱ31个，则目的基因扩增了______ 代．
（3）若用EcoRⅠ和PstⅠ两种限制酶同时切割载体质粒，则能形成______种不同长度的DNA片段，共有______个游离的磷酸基团．
（4）图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是______．
（5）在步骤⑤⑥过程中都需用______处理两类细菌．为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常从分子水平进行检测的方法是用______法．

Answer 1

（1）切割运载体时采用的是限制酶EcoRⅠ、SmaⅠ，为了便于目的基因与运载体定向连接形成重组DNA，还应在基因两侧的A和B位置接上限制酶EcoRⅠ、SmaⅠ的识别序列．
（2）PCR技术利用的是DNA复制的原理，DNA复制具有半保留复制的特点．根据题意可知，若共用了引物Ⅱ31个，说明产生了32个子代DNA分子，由此可见目的基因扩增了5代．
（3）由于质粒是小型环状DNA，若用EcoRⅠ和PstⅠ两种限制酶同时切割载体质粒，则能形成2种不同长度的DNA片段，共有4个游离的磷酸基团．
（4）图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是获取大量重组质粒（让目的基因扩增）．
（5）将目的导入微生物细胞时，需要用Ca²⁺处理微生物细胞，使其成为易于吸收周围环境中DNA的感受态．因此步骤⑤⑥过程中都需用Ca²⁺处理两类细菌．从分子水平检测目的基因是否表达，采用抗原-抗体杂交法．
故答案为：
（1）EcoRⅠ、SmaⅠ
（2）5 
（3）2   4
（4）获取大量重组质粒（让目的基因扩增）
（5）Ca²⁺   抗原-抗体杂交