肝细胞培养各位同仁：我现在进行大鼠肝细胞的原代培养,采用的是四型胶原酶进行肝细胞的分离,但是初次实验时经胎盘蓝染色后发现,细胞差不多全部都损伤了,而且培养几天后细胞均没有贴

Question

肝细胞培养
各位同仁：我现在进行大鼠肝细胞的原代培养,采用的是四型胶原酶进行肝细胞的分离,但是初次实验时经胎盘蓝染色后发现,细胞差不多全部都损伤了,而且培养几天后细胞均没有贴壁,差不多都死了,我想知道胶原酶消化是不是和胰酶一样,需要血清终止反应,且胶原酶的作用时间是多少?请大家多提供宝贵意见!

Answer 1

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase),它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,而不损伤其它蛋白质和组织.胶原酶的化学本质是一种蛋白质,因此,这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感,极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质. 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种.人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶,如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶,它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用.药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂. 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的,主要水解结缔组织中胶原蛋白成分.当拟消化的组织较硬,内含较多结缔组织或胶原成分时,用胰蛋白酶解离细胞的效果较差,这时可采用胶原酶解离细胞法. 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大.因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织,可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害.常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%.胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型. 1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺,脂肪和肾上腺组织细胞的分离.用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞,用于哺乳动细胞的分离. 2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等.它能消化多种组织. 3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等.它可用于胰腺小岛组织的分离,将结缔组织分离成单个细胞. 4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏,骨,甲状腺,心脏和唾液腺组织. 胶原酶的配置 胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏. 注意： 因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌. 钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用,因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制. 胶原酶的使用 1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块 2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液,旋紧盖子（密封烧瓶）. 3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内,每隔3min振摇一次,如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好. 消化时间与组织的类别很有关系,对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织,消化时间4~48h,对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min,也可以根据具体情况而定.如组织块已分散而失去块的形状,一经摇动即成细胞团或单个细胞,可以认为已消化充分.上皮组织经胶原酶消化后,由于上皮细胞对此酶有耐受性,可能仍有一些细胞团未完全分散,但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长,因此,如无特殊需要可以不必再进一步处理. 4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤）,离心1000r/min,5min,去除上清,用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次,去除上清,加培养液制成细胞悬液,接种培养瓶.