结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?

Question

结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?

Answer 1

DNA纯度
在DNA样品中若含有蛋白质,或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子,均会降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用.
2 核酸内切限制酶的缓冲液
核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.
使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液.
不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同,这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同.据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液,在进行双酶解或多酶解时,若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；
先用一种酶进行酶解,然后用乙醇沉淀酶解产物,再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解.
3 酶切消化反应的温度
DNA消化反应的温度,是影响限制内切酶活性的一个重要因素.不同的核酸内切限制酶,具有各自的最适反应温度.多数限制内切酶的最适反应温度是37℃,少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃.
4 DNA的分子结构
DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍.
有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点,其效率也有明显差异.
限制性内切酶反应的终止 通常是采用65℃条件下温浴5min；
加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2+,以终止反应.