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不连续凝胶电泳的原理是什么?
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不连续凝胶电泳的原理是什么?
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答案和解析
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径,而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀.由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应.
1．浓缩效应 样品在电泳开始时,通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍),然后再被分离.当通电后,在样品胶和浓缩胶中,解离度最大的Cl—有效迁移率最大,被称为快离子,解离度次之的蛋白质则尾随其后,解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢,被称为慢离子.由于快离子的迅速移动,在其后边形成了低离子浓度区域,即低电导区.电导与电势梯度成反比,因而可产生较高的电势梯度.这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动.因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面,由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,所以,也就聚集在这个移动的界面附近,逐渐被浓缩,在到达小孔径的分离胶时,已形成一薄层.
2．电荷效应 当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后,甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质,高电势梯度也随之消失,在均一电势梯度和pH的分离胶中,由于各种蛋白质的等电点不同,所带电荷量不同,在电场中所受引力亦不同,经过一定时间电泳,各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带.
3．分子筛效应 由于分离胶的孔径较小,分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时,所受阻滞的程度不同,因而；迁移率不同而被分离.此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时,受阻滞的程度不同,小分子走在前面,大分子走在后面,各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带.
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径,而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀.由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应.
1．浓缩效应 样品在电泳开始时,通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍),然后再被分离.当通电后,在样品胶和浓缩胶中,解离度最大的Cl—有效迁移率最大,被称为快离子,解离度次之的蛋白质则尾随其后,解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢,被称为慢离子.由于快离子的迅速移动,在其后边形成了低离子浓度区域,即低电导区.电导与电势梯度成反比,因而可产生较高的电势梯度.这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动.因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面,由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,所以,也就聚集在这个移动的界面附近,逐渐被浓缩,在到达小孔径的分离胶时,已形成一薄层.
2．电荷效应 当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后,甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质,高电势梯度也随之消失,在均一电势梯度和pH的分离胶中,由于各种蛋白质的等电点不同,所带电荷量不同,在电场中所受引力亦不同,经过一定时间电泳,各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带.
3．分子筛效应 由于分离胶的孔径较小,分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时,所受阻滞的程度不同,因而；迁移率不同而被分离.此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时,受阻滞的程度不同,小分子走在前面,大分子走在后面,各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带.
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