如图是我国利用基因工程方法生产人生长激素的示意图．如图中的质粒是基因工程中常选用的载体一pBR322质粒，ampR表示青霉素抗性基因，tetR表示四环素抗性基因，限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ

Question

如图是我国利用基因工程方法生产人生长激素的示意图．如图中的质粒是基因工程中常选用的载体一pBR322质粒，amp^R表示青霉素抗性基因，tet^R表示四环素抗性基因，限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ切割形成的末端均不相同．据图回答下列问题：

（1）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，③过程采用的酶是______，④过程采用的酶是______．
（2）为了提高⑤过程的成功率，常用______溶液处理大肠杆菌．作为受体的大肠杆菌细胞内，应不含______基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌．
（3）如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同时对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，则形成的DNA片段有______种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段占

(1)/(6)

(1)/(6)

．
（4）按照图示的操作，将三角瓶中的大肠杆菌先接种到甲培养基上，然后分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置，一段时间后，菌落的生长状况如图所示．接种到甲培养基上的目的是筛选______的大肠杆菌．
（5）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？______．为什么？______．

Answer 1

（1）由分析可知，破坏的是青霉素抗性基因，所以用限制酶PstI，而且要保证目的基因和质粒定向连接，所以不能形成相同的黏性末端，故另一种酶选EcoRI酶，将目的基因与运载体连接需要DNA连接酶．
（2）将目的基因导入微生物细胞，常用CaCl₂ 处理，使之成为感受态细胞．由于质粒中含有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，所以受体细胞大肠杆菌中不应含有这两种基因，以便于用筛选．
（3）用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ进行切割，只有任意两个位点被切断且每次机会相等，任意两种酶切割会形成2个DNA片段，所以切割三次共有6个片段且这些片段不等，既得到6种．只有同时用PstI酶和FcoRI酶切割时会得到一个完整四环素抗性基因的DNA片段，故概率为(1)/(6)．
（4）甲培养基中含有四环素，所以培养的是获得含有四环素抗性基因的大肠杆菌．
（5）人的皮肤细胞内存在生长激素基因，但由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞内不能合成生长激素mRNA，所以不能用人的皮肤细胞完成①过程．
故答案为：
（1）Pst I酶 和EcoR I酶  DNA连接酶
（2）CaCl₂    青霉素抗性基因和四环素抗性
（3）6   (1)/(6)
（4）含四环素抗性基因
（5）不能     人的皮肤细胞内存在生长激素基因，但由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞内不能合成生长激素mRNA