人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用．口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效．如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相

Question

人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用．口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效．如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示．请回答下列问题：

限制酶	识别序列和切割位点
EcoRⅠ
BamHⅠ

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是___．科研人员还在两种引物的一端分别加上了___和___序列，以便于后续的剪切和连接．
（2）过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需结构还有___，过程③中需先用___处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞．
（3）过程④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过___过程获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是___．
（4）治疗中发现，用于口服的α-干扰素在胃中会受到一定程度的破坏影响其功效，需要利用___技术加以改造，以达到满意效果．

Answer 1

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列．由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ两种限制酶切割目的基因和质粒，因此科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接．
（2）基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，因此过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点；微生物细胞作为受体细胞时，需要钙离子处理使其变为感受态细胞，即过程③中需先用Ca²⁺处理根瘤农杆菌以便将基因表达载体导入细胞．
（3）在利用反转录法合成目的基因时，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录过程获得DNA，再进行PCR扩增．干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录，这会导致通过该方法不能检测出干扰素基因．
（4）治疗中发现，用于口服的α-干扰素在胃中会受到一定程度的破坏影响其功效，需要利用蛋白质工程技术加以改造，以达到满意效果．
故答案为：
（1）干扰素基因两端的部分核苷酸序列      GAATTC    GGATCC
（2）复制原点    Ca²⁺
（3）逆转录
干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录
（4）蛋白质工程