做细胞转染,预筛选稳定克隆,不表达怎么办最近做细胞转染,预筛选稳定克隆,载体为pEGFP-N1,pIERS现在是平行做几个基因,转然后,只有空载体和一个基因可以看到绿色荧光,其余均没有,这会是什

Question

做细胞转染,预筛选稳定克隆,不表达怎么办
最近做细胞转染,预筛选稳定克隆,载体为pEGFP-N1,pIERS 现在是平行做几个基因,转然后,只有空载体和一个基因可以看到绿色荧光,其余均没有,这会是什么原因呢?怎么补救啊?

Answer 1

首先你要确定你所转染的目的基因本身就是可表达的,建议你用常规的表达载体在没有任何熔合标签【FLAG,X-press之类的】的情况下,用单抗做Western或者是IFA,确定你的基因可以表达,然后再连接eGFP的融合蛋白观测荧光.但是你要注意有的时候,融合蛋白反而会出现不表达的情况.此外,你的目的序列有没有问题?我不知道你的目的基因来源,如果不是来源于一个完成的ORF的话,比如病毒基因的一些NSP,往往是一个大ORF表达一个多聚蛋白,然后剪切生成很多的小蛋白,这种时候需要你预测你的目的基因的起止位置,如果出错的话,即便你能正确的把基因克隆进载体,也无法得到表达.需要你设计新的引物,削减或者是添加一小段序列到你的目的基因中才能重新表达 ……………… 详细资料请参考：on http://product.bio1000.com/100789/