哪些因素影响转录体系的转化率用大肠杆菌做转化表达的时候

Question

哪些因素影响转录体系的转化率
用大肠杆菌做转化表达的时候

Answer 1

答案一：
1．致敏缓冲液中试剂的纯度与浓度对转化率影响很大,试剂必须为分析纯,同时,致敏缓冲液最好避光贮存于40℃.
2．制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴低温操作,同时注意无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染.
3．42℃热处理时间很关键,转移速度要快,且温度要准确,同时注意热处理过程中离心管不要摇动.
4．菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率.
5．实验用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等,应彻底洗净并进行高压消毒,表面去污剂及其他化学试剂的污染往往大幅度地降低转化率.
答案二
影响转化率的关键因素：
①生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态.转化时菌浓度应控制在不超过107／ml.
②CaCl2法0℃放置时间的影响：细菌经0℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加,24h达到最高,之后转化率逐渐下降.
③化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上,联合其他二价金属离子(如Mn2+,CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化率提高100～1000倍.
④质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现,从2kb到3．2kb的转化效率上升,此后到66kb转化效率线性下降.同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75％,线型质粒的转化率更要低100～1000倍,线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因.
⑤菌株基因型recA+与recA-的影响：recA基因是rec系列中最主要的基因,编码同源重组蛋白.考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细菌染色体DNA整合的可能,因而,通常在转化实验中都选用recA-菌株作为宿主菌.