植物表达载体构建的全过程?

Question

植物表达载体构建的全过程?

Answer 1

1.2.5转化农杆菌的PCR鉴定采用文献［4］的方法分别提取农杆菌（EHA105,GV3101）中的mini?Ti质粒,用预先设计的引物进行PCR扩增鉴定,获得可用于遗传转化的农杆菌.
2结果
2.1PCR方法获取hIL?12基因片段以质粒pCA13?hIL?12为模板,运用PCR方法获得全长hIL?12基因（1613 bp,图2）.
2.2重组质粒pBI121?hIL?12的鉴定经限制性内切酶SmaI,SacI酶切后得到大小约1600 bp和12800 bp的大片段,表明hIL?12已经克隆到质粒pBI121中（图3）.质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定,通过序列比对分析发现,目的基因与GenBank中已发表的基因序列完全一致,表明植物表达载体pBI121?hIL?12构建成功.
2.3转化农杆菌的PCR检测从三亲融合后的农杆菌中提取mini?Ti质粒,进行PCR扩增,扩增出大小约1600 bp的片段,与来自大肠杆菌DH5α中的重组质粒pBI121?hIL?12为模板的PCR产物一致,而对照空载根癌农杆菌单菌落为空白,表明获得了2种含hIL?12基因的植物表达载体的农杆菌（图5）.
3讨论
hIL?12是相对分子质量为75 ku的蛋白质,由不同基因编码的2个亚基P35与P40两条肽链通过二硫键结合在一起的异二聚体,研究表明,细胞必须同时表达这两个基因才能产生有活性的IL?12.我们选用的质粒pCA13?hIL?12中的hIL?12基因就是利用这两个亚基具有独立的基因序列特点,将hIL?12两个亚单位进行融合,中间插入一个Linker序列,以保证其基因产物具有正确的蛋白结构及等比例的表达.
实验中选用的载体pBI121是一个常用的植物表达载体,多克隆位点上游带有CaMV35S启动子,在植物组织中能启动外源基因的表达,下游带有GUS报告基因,由于酶切位点的要求,本实验的GUS已被切除,切除了GUS报告基因,给转化子的筛选带来了不便,但这一缺憾可以通过特异性引物进行PCR检测来弥补；在NOS启动子下游带有NPTII基因,可进行Kanamicin抗性筛选.
Mason等［5］提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想.我们构建的植物表达载体pBI121?hIL?12,可以用于马铃薯、烟草、番茄等植物的转化,从而为用植物作为生物反应器生产药用蛋白提供实验基础.目前,将hIL?12基因转入马铃薯的工作正在进行中.我们成功构建了hIL?12基因的植物表达载体,为最终实现用植物生产hIL?12奠定了基础.